Precíziós Nemesítés Csoport részletes bemutatása - Genetika és Biotechnológia Intézet
Precíziós Nemesítés Csoport
Precíziós Nemesítés Csoport részletes bemutatása
Utolsó frissítés: 2022 november 03.
A csoport általános bemutatása
Csoportunk alapvető feladata alkalmazott és felfedező kutatások kivitelezése házinyúlban. Célunk a nyúltenyésztés támogatása genetikai, genomikai, és biotechnológiai módszerekkel, valamint a laboratóriumi nyúl alkalmazása emberi betegségek modelljeként, és ezek biotechnológiai célú hasznosítása. Ez utóbbi esetben a mezőgazdaság egy speciális szeletét fejlesztjük, ahol olyan jelentős hozzáadott értéket képviselő modellállatokat hozunk létre, melyek nem élelmiszerirányú fejlesztések. Munkánkat hazai és külföldi együttműködő partnerekkel végezzük. A kísérleteink során alkalmazzuk a legmodernebb precíziós nemesítési eljárásokat is. Ezek teszteléséhez, valamint esetleges egérmodellek létrehozásához laboratóriumi egérkísérleteket is végzünk
Kutatási témák
- Házinyúl tenyészetek termelőképességének javítása genomikai módszerekkel
- A szív örökletes rendellenességeinek, így különösen szívritmuszavar kialakulásnak modelljei laboratóriumi nyúlban
- Fókuszban az atherosclerosis: új terápiás célpontok és gyógyszerjelöltek azonosítása
- A precíziós nemesítés fejlesztése állati modellekben
1. Házinyúl tenyészetek termelőképességének javítása genomikai módszerekkel
A XXI. század mezőgazdasága csak akkor működhet hatékonyan, fenntartható módon, ha nemcsak a legmodernebb takarmányozási eredményeket, és állattartási technológiákat alkalmazza, hanem folyamatosan fejleszti az állatok genetikai hátterét is. Ez manapság nemcsak hagyományos szelekciót jelent. Az elmúlt 10 évben már genomikai módszereket is használnak a hatékony szelekció támogatására. A nagyüzemi nyúlhús termelés egyik aktuális problémája az antibiotikum nélkül intenzíven hizlalható végtermék előállítása. Ennek nemcsak az antibiotikumok egyre szigorúbb szabályozása miatt van szükség, hanem azért is, mert a tudatos vásárlók egyre inkább keresik az ilyen típusú termékeket.
A nagyüzemi húsnyúl termelés esetén a mucoid enteropathia (epizootic rabbit enteropathy, röviden ERE) komoly gazdasági károkat okoz, melyek jelenleg csak antibiotikumok, illetve antibakteriális készítmények felhasználásával kezelhetők. Az utóbbi évek tenyésztési programjai igazolták, hogy a betegségre való fogékonyságnak van genetikai háttere, melyre érdemes genetikai alapon történő szelekciót indítani. A magyar hycole tenyésznyulak az európai élvonalba tartoznak, de hasonlóan a többi ország tenyésztési programjaihoz csak antibiotikumok segítségével képes a piaci igényeknek megfelelő árú és minőségű végterméket előállítani. Az antibiotikum mentesen felnevelt vágónyulak előállítása így jelentős piaci előnyöket biztosíthatna. Pályázatunk célkitűzése olyan genomi szelekció kialakítása nyúlban, ahol elsősorban az ERE betegség rezisztens vonalát alakítanánk ki úgy, hogy közben a magas termelési tulajdonságok megmaradjanak, esetleg tovább fejlődjenek. A kutatásokat két további NAIK csoporttal, valamint az Állatorvosi Egyetemmel, és a S K-Lap Kft.-vel közösen végezzük. Csoportunk két fontos feladatot visz a közös projektben:
a, Biobank kialakítása
A genomi szelekció sikeres elindításának mindig alapfeltétele egy biobank kialakítása, mely megfelelően reprezentálja azt a populációt, melyben elindul a genomi alapú szelekció. Általánosságban elmondható, hogy minél nagyobb populációra, ezzel együtt minél nagyobb biobankra alapozunk, a genomi szelekció hatékonysága annál nagyobb lesz. Az első évet követően megindultak azok a kísérletek, ahol célzott keresztezésekkel is végeztünk szelekciót (elsősorban a mucoid enteropathia elleni rezisztenciára, de figyelembe véve egyéb gazdasági tulajdonságokat is). A szelekciót a második évben már nemcsak a fenotipusos adatok alapján végeztük, hanem bizonyos esetekben figyelembe vettük a lehetséges genomi adatokat, és a korábban leírt irodalmi (genetikai) markereket is. A következő generációkban ennek megfelelően folyamatosan alakítjuk a biobankot, mely így tartalmazza már azokat a mintákat, melyek reprezentálják a szelekciós lépéseket. Így a második év végére a biobankban 13646 tétel szerepelt, mely azóta is folyamatosan bővül.
A biobank önmagában természetesen használhatatlan. Lennie kell mögötte egy jól használható, folyamatosan fejlesztett adatbázisnak. Mivel az adatbázist sokféle kutató használja egyszerre, ezért a professzionális adatbázis kezelők helyett a Microsoft Exel formátumát választottuk. Ez több szempontból kevésbé hatékony program, azonban mindenki ismeri és tudja kezelni. Ez hosszú távon kifizetődő választás volt. A biobankban különböző szervminták találhatók, a későbbi feladatoknak megfelelően. 12574 db fül, 614 db vér, 230 db sperma, 31 db máj, 53 db egyéb szerv mellett 71 nyálmintát, és 73 metagenom mintát tartalmaz. A minták 19 fajtát/hibridet reprezentálnak. Mivel a célzott nyúlállományunk egy többvonalas hibrid, emiatt szükség van mintákra nemcsak a hibridállományból, hanem az azokat kialakító állományokból is. Emellett szükséges egyéb nyúlvonalak/nyúlfajták mintázása, mert pontos populációgenetikai adatok csak így értelmezhetők.
A biobankban található adatok a szokásos alapadatokon túl (dátum, helyszín, azonosító(k), fajta, ivar) tartalmaznak néhány specifikus elemet is, mely alapvetően a betegséghez kapcsolódnak (súly, diagnózis, rezisztens/szenzitív, tesztelt). Ezt szintén tartalmazza az adatbázis is.
A fenti biobankból származó mintákból kialakítottunk egy DNS bankot is. A megfelelő kritériumok alapján kiválasztott mintákból tisztítottunk DNS-t. A DNS bankban 1671 tisztított DNS minta volt megtalálható. Minden mintának ismert a koncentrációja, valamint a szennyező anyagok (pl. fehérje) koncentrációja. Az 1671 mintából 464 tovább higított, ismert koncentrációjú minta került kialakításra a további downstream applikációknak (genotipizálás, genomszekvenálás) megfelelően. A biobankhoz kapcsolódó adatbázisban külön munkalapként jelenítettük meg a DNS adatbankot, valamint a higított DNS-ek adatait.
b, Alfeladat- Ex-situ biobank előkészítése: nyúlvonalak sperma és embrió fagyasztása
A spermabankok kialakítása speciális fajták/vonalak esetén nagy szerepet játszik az állattenyésztésben. A nyulak esetén a spermafagyasztás/felolvasztás és termékenyítés hatékonysága még nem éri el az üzemi körülmények között elvárható hatékonyságot. Emiatt az első évben fejlesztettünk egy olyan nyúlsperma fagyasztási protokollt, melyben a célunk a magas termékenyítési ráta elérése volt, ennek megfelelően állítottuk be in vitro körülmények között az optimális fagyasztási protokollt. Rövid felolvasztási optimalizálást követően laboratóriumi körülmények között elkezdtük a termékenyítési kísérleteket. Ez azt jelenti, hogy ilyen körülmények között a fagyasztás/olvasztás optimális, azonban a rendelkezésre álló anyák minősége alacsony, illetve változó. Tizennégy termékenyítési kísérletben legrosszabb esetben 40%, legjobb esetben 70% termékenyülést értünk el. Az alap protokoll segítségével 40%-os termékenyülést értünk el, ezt folyamatos fejlesztésekkel 70%-os termékenyülési rátára emeltük. A kísérletnek most kezdődött a második szakasza, ahol telepi körülmények között, kiváló minőségű anyákat termékenyítettünk. A felolvasztás, és lefagyasztás viszont ilyen körülmények között szuboptimális. A termékenyülés magas volt (85%), mely már az üzemi körülmények között is használható nagy értékű vonalak fenntartásához. A magas termékenyülési arány azonban alacsony alomszámmal párosult. A technika így további finomítást igényel, ehhez azonban valószínűleg az üzemi termékenyítési technológián is változtatni kell. Ez optimális sperma fagyasztási/felolvasztási körülményeket, és esetlegesen jelentősen megemelt termékenyítési térfogatot feltételez.
2. A szív örökletes rendellenességeinek, így különösen szívritmuszavar kialakulásnak modelljei laboratóriumi nyúlban
Az elmúlt években jelentősen felértékelődtek azok az állatmodellek, melyek emberi betegségek megjelenését próbálják minél pontosabban visszaadni. Ezek a modellek gyakran nem a hagyományos rágcsáló (egér, patkány) modellek. Ennek az az oka, hogy az emberben található fiziológiai és molekuláris útvonalak gyakran nem egyeznek meg ez egérben található biológiai útvonalakkal. Ezzel szemben a nyúl mind élettani, mind molekuláris paramétereiben közelebb áll az emberhez. Emiatt, azok a kutatások, ahol a nyulat használjuk modellállatként, jelentős hozzáadott értéket képviselnek. Az egyik jelentős terület, ahol a nyúl fontos modellállat, az a szív és érrendszeri kutatások területe. Ezen belül a szívritmuszavarokat kialakító mutációk kutatásában hozhat a nyúl mint modellállat jelentős sikereket. A szív speciális funkciójához köthető ionáramok mozgását speciális ioncsatornák végzik az emlősállatokban. Ezek felépítése, és szabályozása minden fajban különbözik. A különbségek-hasonlóságok azonban jelentősek lehetnek. Az ember ebből a szempontból viszonylag közel áll a nyúlhoz. Emiatt, ha az emberben megtalálható ioncsatorna mutációkat kialakítjuk nyúlban, akkor a betegség modelljét hozhatjuk létre, ami fontos lépés a terápiás lehetőségek kialakításához. Ezen a területen sikerült létrehozni a hosszú QT szindróma (az EKG egyspeciális szakaszának meghosszabodása) és az ehhez kapcsolódó hirtelen szívhalál nyúlmodelljét. Korábban más kutatócsoportok kialakították az LQT1, LQT2 és LQT3 típusú szindrómát modellező nyulakat. A mi kísérleteink célja egy LQT5 szindrómát modellező nyúl előállítása volt, amely egy mutáns KCNE1 csatorna fehérjét hordoz. Ezt a mutációt először egy LQT5 szindrómás családban írták le. A betegségmodell nyúl elektrofiziológiai tulajdonságainak alapvizsgálata megtörtént. Az LQT5 betegségmodell nyulunkat sikeresen kereszteztük egy OTKA pályázatkeretében LQT2 nyulakkal. A létrejött kettős mutáns LQT2-5 nyulakban kialakult repolarizációs problémák lehetőséget biztosíthatnak arra, hogy hosszú távon a farmakológiai kutatások akár több ioncsatornát érintő gyógyszerjelölt vegyületek tesztelését is kivitelezni lehessen. Magas hozzáadott értéket képviselő nyúlmodellünkkel szeretnénk közelebb jutni a hirtelen szívhalál okainak pontosabb megismeréséhez. 2020-ban eredményeinket a kettős mutáns nyúlban szeretnénk közölni a British Journal of Pharmacology újságban.
3. Fókuszban az atherosclerosis: új terápiás célpontok és gyógyszerjelöltek azonosítása- NVKP 16-1-2016-0039
A Semmelweis Egyetem, az ImmunoGenes Kft., valamint a Nemzeti Agrárkutatási és Innovációs Központ – Mezőgazdasági Biotechnológiai Kutatóintézet (NAIK-MBK) által alkotott konzorcium célja, hogy innovatív, molekuláris biológiai, immunológiai és géntechnológiai módszereket alkalmazó kutatással páciens minták analízisével, valamint a kutatási eredmények hasznosításával közelebb kerüljünk az atherosclerosis hátterében álló folyamatok megismeréséhez és gyógyszeres befolyásolásához. Ehhez csoportunk egy speciális technikával az ún. CRISPR/CAS9 módszerrel génkiütött nyúlmodelleket hoz létre. A génkiütött nyúlmodellek keresztezésével kettős KO nyulak létrehozása a cél, melyekben a gének funkcionális vizsgálata hatékonyan kivitelezhető. A fent említett technológia a legmodernebb precíziós nemesítési módszer. A kísérletek során a SOTE által már korábban vizsgált két gént, a Nox5, valamint a Nox4 jelű génekben hoztunk létre célzottan olyan mutációkat, melyek következtében a gének nem termelnek aktívan Nox5 és Nox4 fehérjéket. Ezeknek a fehérjéknek speciális szerepük van a szervezetben, mégpedig a szabadgyökök képzése. A szabadgyökök képződése, a közismert káros hatások mellett, élettani körülmények között fontos szabályozó szerepet tölt be az emlős szervezetek működésében. Rengeteg élettani folyamat, a szervezet legkülönfélébb szöveteiben használja szignál molekulaként a szervezet által termelt szabadgyököket. Míg korábban a szabadgyököket majdnem kizárólagosan káros molekuláknak könyvelték el, a mai álláspont szerint a káros hatásokat sokkal inkább az okozza, hogy modern környezetünk hatására arányuk jelentősen megemelkedik, a szignál folyamatok zavart szenvednek, és ez széleskörű kóros élettani folyamatokat eredményez. Szerepükhöz képest viszonylag keveset tudunk azokról az enzimekről, melyek a szabadgyök képződés kulcsenzimei. Ezek a NADPH oxidázok.
A NADPH oxidázok pontos funkcionális jellemzéséhez elengedhetetlen olyan állatmodellek kialakítása, melyekben célzottan elrontjuk a megfelelő enzim működését.
A NADPH-oxidázok a molekuláris oxigént szuperoxid gyökké redukálják, miközben az általuk kötött NADPH molekula oxidálódik. Az így keletkezett szuperoxid gyök enzimatikus és nem enzimatikus úton alakulhat át hidrogén-peroxiddá, melynek továbbalakulása során további változatos reaktív oxigénszármazékok (ROS) keletkezhetnek. A jelenleg ismert hét NADPH-oxidáz izoforma rengeteg élettani folyamatban vesz részt, azonban egyes izoformáknak (pl. NOX4) a funkciója máig nem pontosan felderített, illetve léteznek olyan izoformák, melyeknek bizonyos funkciói ismertek, ám expressziós profiljuk alapján feltételzhető, hogy további élettani folyamatokban játszhatnak szerepet.
Munkánk során munkacsoportunk a SOTE Élettani Intézetével együttműködésben Dr. Geiszt Miklós munkacsoportjával létrehozott Nox5 és Nox4 hiányos nyulakat. A létrehozott alapító egyedekből transzgénikus heterozigóta, valamint homozigóta vonalakat hozunk létre, és a különböző szövetekben vizsgáljuk a fehérjék szerepét a funkcióhiányos mutánsokon keresztül. Eredményeink szerint a Nox5 gén fontos szerepet tölthet be az érelmeszesedés kialakulásában. Ehhez erős bizonyítékokat sikerült találni a NOX5 génhiányos nyúlvonalak elemzése során. Eredményeinket hamarosan közöljük ezen a területen. Az elmúlt hónapokban sikerült kialakítani a NOX5-NOX4 kettős transzgénikus vonalakat is, melyeknek elemzése ezévi legfontosabb feladatunk.
4. A precíziós nemesítés fejlesztése állati modellekben
A fent említett genom editálási technikák rohamosan fejlődnek. Ahhoz, hogy nemzetközi szinten lépést tarthassunk a területtel, a fenti technológiákat mi is folyamatosan fejlesztjük. Mivel a nyúlmodellekben az alapvető fejlesztések nagyon drágák, ezért tesztrendszerként használunk sokkal olcsóbb egérmodelleket is. Természetesen az egérmodellek fejlesztését is kapcsoljuk valamilyen értékes, és hasznosítható génhez. Jelenleg két kisebb projektben folynak ezek a fejlesztések:
a, Az autizmus spektrum zavar genetikai hátterének vizsgálata egérmodellben.
Ez a projekt egy új, nemzetközi TÉT pályázat keretében valósul meg. A projekt célja genomszerkesztési eljárással knock-out és knock-in egérmodell előállítása a további funkcionális in vivo analízishez a molekuláris, pszichológiai, funkcionális, és viselkedéses faktorok közötti kapcsolat vizsgálatára ASD egérmodellben. A projekt kollaborációs nemzetközi téma, szlovén közreműködőkkel.
b, Dutpase hiányos egérmodellek vizsgálata
Precíziós nemesítési eljárásaink másik célpontja egy speciális DNS javító enzim, a Dutpase. Ezt az enzimet a DUT gén kódolja. Igazoltuk, hogy teljes hiányában az emlős szervezet nem képes kifejlődni, hanem korai embrionális korban elpusztul. További vizsgálatokat tervezünk a gén pontos molekuláris funkicóinak vizsgálatára, speciális bázis editor rendszerekben, az ELKH- TTK kutatóival közösen. Ehhez jelenleg megpróbálunk új pályázati forrásokat is bevonni.
A csoport tagjai
|
Dr. Bodrogi Lilla, tudományos főmunkatárs, posztdoktor, csoportvezető M.Sc.: biológus-biotechnológus, angol-magyar szakfordító Debreceni Egyetem, Természettudományi Kar, 1998-2002 |
|
Hiripi László, tudományos tanácsadó, tanszékvezető
Telefon: +36-28/430-494 / 4253, 4152 E-mail: Hiripi.Laszlo@uni-mate.hu |
|
Pintér Tímea, tudományos segédmunkatárs, PhD hallgató M.Sc.: Szent István Egyetem, Mezőgazdasági és Környezettudományi Kar, mezőgazdasági biotechnológus szak, 2016-2018 |
|
Dr. Skoda Gabriella, tudományos segédmunkatárs, posztdok M.Sc.: biológus, Szent István Egyetem, ÁOTK, 2009-2011 |
|
Dr. Kerekes Andrea, tudományos munkatárs, posztdok M.Sc.: Szent István Egyetem, Mezőgazdasági és Környezettudományi Kar, Agrármérnők 2006-2008 |
|
Plank Patrik, kutatási asszisztens Telefon: +36-28/430-494 / 4160 E-mail: Plank.Patrik@uni-mate.hu |
Együttműködő MATE-kutatók
- Dr. Gócza Elen, DSc
- Dr. Hoffmann Orsolya, PhD
Szakdolgozatok, 2018-2020:
Zsidai Sándor
CRISPR-Cas9 rendszer off-target hatásainak molekuláris vizsgálata NOX4 knock-out nyúlvonalakban
Biológia mesterszak, Molekuláris Genetika, Sejt- és Fejlődésbiológia szakirány szakirány ELTE, 2021
Lakat Tamás
CRISPR konstrukciók in vitro és in vivo tesztelése és jellemzése nyúl PXDNL génre MSc biomérnök hallgató, egészségvédelmi szakirány
2019 BME
Mester Júlianna
Offtarget helyek molekuláris vizsgálata CRISPR/Cas9 módszerrel létrehozott, genom szerkesztett nyúlvonalban
Biológus MSc hallgató
Debreceni Egyetem, 2020